Produse

Modul în care efectele mutațiilor simultane se combină pentru a schimba activitatea enzimatică nu este ușor de previzibil, deoarece aceste efecte nu sunt întotdeauna aditive într-o manieră liniară.Prin urmare, caracterizarea efectelor mutațiilor simultane ale resturilor de aminoacizi care leagă substratul poate aduce o contribuție semnificativă la înțelegerea specificității substratului enzimelor.În beta-glicozidaza de la Spodoptera frugiperda (Sfbetagly), ambele reziduuri Q39 și E451 interacționează cu substratul și acest lucru este esențial pentru definirea specificității substratului.Duble mutanți de Sfbetagly (A451E39, S451E39 și S451N39) au fost preparați prin mutageneză direcționată, exprimați în bacterii și purificați utilizând cromatografie de afinitate.Aceste enzime au fost caracterizate folosind p-nitrofenil beta-galactozidă și p-nitrofenil beta-fucozidă ca substraturi.Raportul k cat/Km pentru mutanții simple și dubli ai Sfbetagly care conțin mutații direcționate la situs la pozițiile Q39 și E451 a fost utilizat pentru a demonstra că efectul asupra energiei libere a pumnalului ESdouble (complex de stare de tranziție enzimatică) al mutațiilor duble (Gdouble). daggerxy) nu este suma efectelor rezultate din mutațiile unice (Gdouble daggerx și Gdouble daggery).Această diferență în Gdouble pumnal indică faptul că efectele mutațiilor individuale se suprapun parțial.Prin urmare, acest efect comun contează o singură dată în Gdouble daggerxy.Datele cristalografice despre beta-glicozidaze relevă prezența unei legături de hidrogen bidentate care implică reziduurile Q39 și E451 și aceeași grupare hidroxil a substratului.Prin urmare, atât datele termodinamice, cât și cele cristalografice sugerează că reziduurile Q39 și E451 exercită o influență reciprocă asupra interacțiunilor lor respective cu substratul.