Produse

Înțelegerea metabolismului gazdei microbiene este esențială pentru dezvoltarea și optimizarea proceselor biocatalitice bazate pe celule întregi, deoarece dictează eficiența producției.Acest lucru este valabil mai ales pentru biocataliza redox, în care celulele active metabolic sunt folosite datorită capacității de regenerare a cofactorului/cosubstratului endogene în gazdă.Escherichia coli recombinantă a fost utilizată pentru supraproducția de prolină-4-hidroxilază (P4H), o dioxigenază care catalizează hidroxilarea L-prolinei libere în trans-4-hidroxi-L-prolină cu a-cetoglutarat (a-KG) ca cosubstrat.În acest biocatalizator cu celule întregi, metabolismul central al carbonului oferă cosubstratul necesar a-KG, cuplând performanța biocatalitică P4H direct cu metabolismul carbonului și activitatea metabolică.Prin aplicarea instrumentelor de biologie experimentală și computațională, cum ar fi ingineria metabolică și analiza fluxului metabolic (13)C ((13)C-MFA), am investigat și descris cantitativ răspunsul fiziologic, metabolic și bioenergetic al biocatalizatorului cu celule întregi. la bioconversia vizată și a identificat posibile blocaje metabolice pentru o inginerie rațională a căii ulterioare. O tulpină de E. coli cu deficit de degradare a prolinei a fost construită prin ștergerea genei putA care codifică prolină dehidrogenaza.Biotransformările celulelor întregi cu această tulpină mutantă au condus nu numai la hidroxilarea cantitativă a prolinei, ci și la o dublare a ratei specifice de formare a trans-4-L-hidroxiprolinei (hyp), în comparație cu tipul sălbatic.Analiza fluxului de carbon prin metabolismul central al tulpinii mutante a arătat că cererea crescută de a-KG pentru activitatea P4H nu a sporit fluxul generator de a-KG, indicând o funcționare strâns reglată a ciclului TCA în condițiile studiate.La tulpina de tip sălbatic, sinteza și cataliza P4H au determinat o reducere a randamentului de biomasă.Interesant, tulpina ΔputA a compensat suplimentar pierderea asociată de ATP și NADH prin reducerea cererilor de energie de întreținere la rate de absorbție a glucozei relativ scăzute, în loc să mărească activitatea TCA. să fie promițătoare pentru cataliza productivă a P4H nu numai în ceea ce privește randamentul de biotransformare, ci și în ceea ce privește ratele de biotransformare și absorbția prolinei și randamentul hyp pe sursa de energie.Rezultatele indică faptul că, la un knockout putA, cuplarea ciclului TCA la hidroxilarea prolinei prin cosubstratul a-KG devine un factor cheie de constrângere și o țintă pentru îmbunătățirea în continuare a eficienței biotransformărilor dependente de a-KG.