Produse

Nou test de cromatografie lichidă de înaltă performanță pentru glicoziltransferaze bazat pe derivatizare cu acid antranilic și detectarea fluorescenței.

Testele au fost dezvoltate folosind chimia unică de etichetare a acidului 2-aminobenzoic (2AA; acid antranilic, AA) pentru măsurarea activităților atât ale β1-4 galactosiltransferazei (GalT-1) cât și ale α2-6 sialiltransferazei (ST-6) prin lichid de înaltă performanță. cromatografie (HPLC) cu detectarea fluorescenței (Anumula KR. 2006. Advances in fluorescence derivatization methods for high-performance liquid chromatographic analysis of glycoprotein carbohydrates. Anal Biochem. 350:1-23).N-acetilglucozamina (GlcNAc) și N-acetillactozamina au fost utilizate ca acceptori și uridin difosfat (UDP)-galactoză și citidin monofosfat (CMP)-acid N-acetilneuraminic (NANA) ca donatori pentru GalT-1 și, respectiv, ST-6.Produsele enzimatice au fost marcate in situ cu AA și au fost separate de substraturi pe coloana TSKgel Amide 80 folosind condiții de fază normală.Unitățile enzimatice au fost determinate din zonele de vârf prin comparație cu standardele derivatizate concomitent Gal-p1-4GlcNAc și NANA-a2-6 Gal-p1-4GlcNAc.Au fost stabilite liniaritatea (timp și concentrația enzimatică), precizia (intra și intertest) și reproductibilitatea testelor.Testele s-au dovedit a fi utile în monitorizarea activităților enzimatice în timpul izolării și purificării.Testele au fost foarte sensibile și au avut rezultate egale sau mai bune decât măsurătorile tradiționale pe bază de zahăr radioactiv.Formatul de analiză poate fi utilizat și pentru măsurarea activității altor transferaze, cu condiția ca acceptorii de carbohidrați să conțină un capăt reducător pentru marcare.Un test pentru acceptorii de glicoproteine ​​a fost dezvoltat folosind IgG.A fost dezvoltată o scurtă metodă de profilare HPLC pentru separarea glicanilor IgG (biantenar G0, G1, G2, mono- și dizialilați), care a facilitat determinarea activităților GalT-1 și ST-6 într-o manieră rapidă.În plus, această metodă de profilare ar trebui să se dovedească utilă pentru monitorizarea modificărilor glicanilor IgG în setările clinice.